Mecanismos fotobioquímicos de biomoléculas relevantes para la irradiación ultravioleta germicida a 222 y 254 nm.

Scientific Reports volumen 12, número de artículo: 18217 (2022) Citar este artículo

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Para inactivar virus y microorganismos, la luz ultravioleta en la región de longitud de onda corta es un candidato prometedor para mitigar la infección de enfermedades. Las lámparas germicidas de mercurio que emiten a 254 nm y las lámparas excimer de KrCl que emiten a 222 nm tienen propiedades de esterilización. En este trabajo, se investigó la dependencia de la longitud de onda de los mecanismos fotobioquímicos con irradiación de 222 y 254 nm para analizar los mecanismos de daño subyacentes del ADN/ARN y las proteínas, utilizando Escherichia coli, una proteasa, un oligopéptido, aminoácidos, ADN plasmídico y nucleósidos. . También se investigó la fotorreparación del ADN dañado y la reversión "oscura" de los hidratos de los bloques de acoplamiento de uracilo fosforamidita.

La irradiación con luz ultravioleta (UV) es una forma eficaz de inactivar virus y microorganismos con mínimos efectos indeseables en la salud de los mamíferos o en la piel y los ojos1,2,3,4,5. Estudios anteriores han evaluado la respuesta de los patógenos en longitud de onda con el objetivo de garantizar que los sistemas de desinfección UV protejan adecuadamente la salud humana, por ejemplo, del SARS-CoV-26,7,8. Un enfoque para prevenir la transmisión de virus es inactivar patógenos transmitidos por el aire en espacios públicos y de transporte, oficinas de empresas y hospitales cuando los espacios están ocupados por personas. Este enfoque sin dañar la piel expuesta del mamífero se puede lograr mediante una profundidad de penetración óptica corta de la luz ultravioleta. Una dosis baja a 222 nm fue eficaz para inactivar los coronavirus en aerosol6. Se realizó irradiación a 222 nm sobre láminas de células en capas, y se concluyó que la irradiación UV es biológicamente segura para la viabilidad celular9,10. Se aplicó una luz de 222 nm de amplio espectro sin filtrar para controlar los patógenos transmitidos por los alimentos11. Según la literatura de "una recopilación y análisis de cien años de datos sobre los resultados sobre el impacto de la irradiación UV en microorganismos, células humanas y animales, piel y ojos", las dosis medias de reducción logarítmica necesarias a 222 nm son ligeramente superiores. en comparación con la irradiación a 254 nm, y una dosis adecuada debería reducir la mayoría de los patógenos en la mayoría de los medios en varios órdenes de magnitud sin dañar la piel ni los ojos humanos12.

La irradiación ultravioleta induce daños a las proteínas y los ácidos nucleicos. La irradiación a 254 nm inactivó el SARS-CoV-2 mediante la inducción de daño al genoma viral y no dañó las proteínas virales12. Las proteínas de la matriz y la nucleocápside de virus y microorganismos absorben la luz ultravioleta y reducen la densidad de la luz que llega a los ácidos nucleicos. Así, en longitudes de onda UV cortas, el mecanismo germicida es principalmente la degradación de proteínas, mientras que en longitudes de onda UV largas, los ácidos nucleicos se dañan1,2,13,14,15,16. El ácido ribonucleico (ARN) y el ácido desoxirribonucleico (ADN) constan de una proteína principal de azúcar-fosfato y bases de pirimidina/purina. Los espectros de acción UV para la inducción de dímeros de pirimidina de ciclobutano (CPD) y fotoproductos de pirimidina (6-4)pirimidona ((6-4)PP) en el ADN alcanzan su máximo a 260 nm y coinciden con el espectro de absorción del ADN disuelto en solución salina tamponada con fosfato, lo que implica que La fotoabsorción directa por timina induce lesiones en el ADN17. Se informaron conocimientos mecanicistas sobre la formación fotoquímica de un aducto hidrato de la nucleobase de ARN en un ambiente acuoso18.

En este artículo, informamos los mecanismos fotoquímicos de la irradiación UV a 222 y 254 nm en biomoléculas relevantes para virus y microorganismos; (a) degradación de aminoácidos aromáticos, un oligopéptido, una proteasa y proteínas, (b) degradación del ADN plasmídico y su proceso de fotorreparación tras ser transformado en células de Escherichia coli (E. coli), (c) degradación de un cofactor en el Proceso enzimático de fotorreparación de CPD, (d) degradación de nucleósidos, (e) rendimiento de productos de ARN UpU y ADN dTpdT, y (f) autorreversión de la UpU fotohidratada en condiciones de oscuridad.

Para las mediciones de supervivencia de las células del bacteriófago MS2 de E. coli, después de la irradiación UV, se realizó el recuento de placas de las células cultivadas durante 24 h en placas de agar Luria-Bertani (LB) como se muestra en la Fig. 1a. La irradiación de 222 nm resultó en una desintegración 1,5 veces más rápida que la irradiación de 254 nm. La Figura 1b muestra las curvas de fotorreparación de 365 nm (0,5 mJ/cm2) de células K-12 de E. coli después de la exposición a rayos UV a una dosis de 9 mJ/cm2 a 222 y 254 nm. Las células irradiadas a 222 nm no se recuperaron, mientras que las de 254 nm sí. El proceso de reparación "oscuro" posterior a la fotólisis después de la exposición a los rayos UV en E. coli K-12 a 222 y 254 nm no se observó durante la incubación de 6 h.

( a ) Tasas de supervivencia del bacterófago MS2 de E. coli bajo irradiación UV. Escala logarítmica base 10. (Círculo negro) 222 nm, (Diamante negro) 254 nm. La relación de susceptibilidad, k(222 nm)/k(254 nm) es 1,5 para las desintegraciones. N = 2 y n = 3, (b) (mitad izquierda) tasas de supervivencia de E. coli K-12 irradiadas a 222 y 254 nm, (mitad derecha) tasas de fotorreparación por irradiación a 365 nm. (Círculo negro) irradiación de 222 nm seguida de irradiación de 365 nm, (círculo blanco) irradiación de 222 nm seguida de preservación en condiciones de oscuridad (experimento de control), (diamante negro) irradiación de 254 nm seguida de irradiación de 365 nm, ( diamante blanco) irradiación de 254 nm seguida de conservación en condiciones de oscuridad (experimento de control). norte = 2 y norte = 3.

La densitometría de imagen en la Fig. 2a muestra electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio con DTT agregado y sin calentamiento para detectar firmas de proteínas de E. coli K-12 (6,9 log UFC / ml). Una dosis de 50 mJ/cm2 a 222 nm redujo la intensidad densitométrica de las firmas de mayor masa molar, mientras que no se observó una reducción significativa con una dosis de hasta 500 mJ/cm2 a 254 nm. Se observó una dependencia similar de la longitud de onda de la albúmina sérica bovina, como se muestra en la figura complementaria S1.

(a) SDS-PAGE de la firma de la proteína K12 de E. coli después de la exposición a dosis crecientes de luz UV hasta 500 mJ/cm2, como se muestra en cada carril para irradiación de 222 y 254 nm. (b) Tinción fluorescente de E. coli K12 después de la irradiación UV. (superior) 222 nm y (inferior) 254 nm con una dosis de 200 mJ/cm2.

El daño a la membrana celular de E. coli K-12 se confirmó utilizando el método de tinción fluorescente en la Fig. 2b con una dosis de 200 mJ/cm2. La fluorescencia roja del yoduro de propidio fue dominante en la muestra irradiada a 222 nm, lo que implica que las células estaban muertas con membranas celulares comprometidas. La muestra irradiada a 254 nm emitió fluorescencia verde del tinte SYTO9 en las membranas celulares, lo que implica que las células tenían membranas celulares intactas.

Los espectros de absorción de soluciones acuosas de los aminoácidos aromáticos comunes, triptófano (Trp), tirosina (Tyr), fenilalanina (Phe) e histidina (His), se muestran en la figura complementaria S2. El suyo tiene absorción a 222 nm pero no a 254 nm. Trp y Tyr tienen una fuerte absorción tanto a 222 como a 254 nm, mientras que Phe tiene una absorción débil. Una proteasa, quimotripsina, cataliza la hidrólisis del enlace peptídico de Bz-Tyr-pNA (BTPNA en 50% DMSO / 50% agua) en su bolsillo de unión S1 de His 57, Ser 195 y Asp 102. Evaluar la inhibición UV de la actividad catalítica. , aq. Se irradiaron soluciones de HCl de α-quimotripsina a 222 y 254 nm (0,5 mW/cm2) con dosis de 100 y 500 mJ/cm2. Después de la irradiación UV a α-quimotripsina, se monitoreó una mezcla de la solución de α-quimotripsina (75 μg/mL) y una solución de BTNPA a una longitud de onda de sonda de 405 nm en una solución tampón Tris∙HCl, sondeando el producto de hidratación, p- nitroanilina, como se muestra en la Fig. 3. La dosis más alta y la longitud de onda UV más corta dieron como resultado una menor producción de p-nitroanilina. Las relaciones de las pendientes, r = (irradiado con UV)/(control), corresponden a las actividades catalíticas residuales. Para una dosis de UV de 100 mJ/cm2, que se obtiene a partir de los datos entre t = 10-20 min en la Fig. 3, r(222 nm) es 0,30, mientras que r(254 nm) es 0,81, lo que sugiere que la actividad fue 3,5 (= 70/19) veces reducido por la irradiación de 222 nm que por la irradiación de 254 nm. Los efectos de la dosis de UV en los espectros de absorción de las soluciones de α-quimotripsina se midieron para dosis de 0 a 500 mJ/c2, como se muestra en la figura complementaria S3. Los espectros de absorción tienen un pico alrededor de 280 nm debido a los residuos de aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr y Phe). Estos cromóforos absorben fotones de 254 nm para desordenar la estructura y disminuir la capacidad catalítica sin ningún cambio apreciable en su espectro de absorción. El cambio espectral después de la irradiación de 222 nm se demostró a 225 nm (disminución de la absorbancia) y 250 nm (aumento). Las disminuciones en la capacidad catalítica y la intensidad espectral de absorción implican la fotodegradación de la cadena lateral de His en el bolsillo de unión ya que (a) His no solo estabiliza las cargas en desarrollo, sino que también proporciona un camino para la transferencia de protones, sin el cual las reacciones catalíticas tendrían dificultades en procediendo, y (b) El suyo es un cromóforo fuerte a 222 nm.

Producción de p-nitroanilina mediante el seguimiento de la intensidad de absorción a 405 nm después de la irradiación UV con soluciones acuosas de quimotripsina. Las dosis de UV en mJ/cm2 son (diamante azul) 100 y (círculo azul) 500 a 222 nm, (diamante verde) 100 y (círculo verde) 500 a 254 nm, (círculo negro) 0. La joroba inicial es causada por la luz. dispersión. norte = 1.

En cuanto a la pequeña reducción en la actividad catalítica, r, después de la irradiación de 254 nm, His es relevante debido a su débil fotoabsorción. Aunque la reacción catalítica se inhibió, la figura complementaria S3 muestra solo un ligero cambio en los espectros de absorción de UV después de la irradiación de 254 nm. Esto se debe a que los fotoproductos pueden tener un espectro UV similar al de la α-quimotripsina original. McLaren y Luse19 informaron que, en su irradiación de 254 nm a quimotripsina mediante análisis químico, se destruyó aproximadamente un residuo de Trp por molécula de quimotripsina y no se rompió ninguno de los enlaces disulfuro. No se cambiaron Phe, Tyr ni sus residuos.

Para evaluar aún más el papel de los residuos, se irradió con luz ultravioleta un oligopéptido, la angiotensina II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) en solución acuosa (50 μM) a 222 y 254 nm. El análisis por HPLC para una dosis de 100 mJ/cm2 se muestra en la Fig. 4a. Para la irradiación de 222 nm, los picos laterales de los péptidos fotoproducidos se observaron en dos longitudes de onda de monitor de 215 y 280 nm, mientras que no se observaron picos laterales para la irradiación de 254 nm. Las flechas rojas indican el fotoproducto asignado a un péptido que contiene Tyr desde que aparecieron mediante monitorización tanto a 215 como a 280 nm. El azul a un péptido que contiene los productos de la fotodegradación de His ya que aparece con fuerza a 280 nm. La Figura 4b muestra que la irradiación a 222 nm indujo una fuerte reducción, mientras que fue muy débil a 254 nm. Las variaciones dependientes de la dosis en las intensidades máximas de HPLC se muestran en la figura complementaria S4. Para la dosis de 0 a 1,0 J/cm2, la intensidad del producto aumentó y la intensidad de la angiotensina II disminuyó. La Figura 4b también muestra el efecto de desaireación de soluciones acuosas con gas N2 burbujeando bajo sonicación. La desaireación sólo cambió ligeramente la tasa de reducción.

(a) Perfiles de elucidación por HPLC después de la irradiación UV de angiotensina II con una dosis de 100 mJ/cm2 a 222 y 254 nm. Las longitudes de onda de monitoreo son (superior) 215 nm y (inferior) 280 nm. Las flechas rojas indican el fotoproducto asignado a un péptido que contiene tirosina, y la azul a un péptido que contiene el producto de la fotodegradación de histidina. (b) reducción de angiotensina II mediante irradiación UV. (Círculo azul) 222 nm y (diamante verde) 254 nm con aq. soluciones aireadas, (círculo amarillo) 222 nm con ac. soluciones desaireadas. norte = 3.

La Figura 4b muestra la dependencia de la longitud de onda de la reducción de angiotensina II con una fuerte reducción por irradiación a 222 nm y casi ninguna reducción a 254 nm. Para evaluar el papel de fotodegradación de los residuos de aminoácidos, Tyr, Trp, Phe e His libres, aq. Se irradiaron soluciones (50 μM) a 222 y 254 nm para dosis de 0 a 2 J/cm2 en la figura complementaria S5. Los porcentajes residuales a una dosis de 1,0 J/cm2 fueron los siguientes: a 222 nm His (< 1%): Trp (16%): Tyr (38%): Phe (82%), y a 254 nm His (100 %):Trp (71%): Tyr (88%): Phe (95%). Tyr se reduce apreciablemente a 254 nm y ca. ocho veces menos reducido que el His a 222 nm. Por lo tanto, la susceptibilidad a la fotorreducción de His coincide con la dependencia de la longitud de onda de las tasas de reducción observadas de la angiotensina II en la Fig. 4b, mientras que no con Tyr, ya que Tyr libre tiene una absorción apreciable a 245 nm y His no tiene absorción. El efecto de desaireación de la solución de angiotensina II es pequeño en la Fig. 4b. En el proceso de oxidación de aminoácidos aromáticos libres, se sabe que His y Trp reaccionan a velocidades apreciables con el oxígeno singlete20. Como se muestra en la figura complementaria S5, la desaireación disminuyó dos veces la tasa de reducción de UV para Trp durante la irradiación de 222 nm, pero no para His. Por tanto, el residuo de His es el más plausible para la reducción UV de la angiotensina II. La desaireación de aq. La solución no brindó protección contra la degradación de His a 222 nm, lo que implica que la fotoquímica primaria a 222 nm es fotodegradación directa e independiente del O2 disuelto.

Después de la excitación UV en el ADN, las pirimidinas adyacentes pueden formar lesiones, CPD o (6-4)PP. La lesión CPD se fotorrepara con una fotoliasa y una coenzima (flavin adenina dinucleótido, FAD) mediante luz de longitud de onda larga, mientras que la lesión (6-4)PP no. Examinamos el daño UV del ADN plasmídico (1, 5, 10 pg) en soluciones tampón Tris∙EDTA a 222 y 254 nm, que se transformaron en células competentes de E. coli HB101 después de la irradiación UV. La Figura 5 muestra las curvas de eficiencia de transformación, para las cuales los datos sin procesar del recuento de colonias se enumeran en la Tabla complementaria S1. Las dosis a 21 y 40% de transformación fueron 68 y 34 mJ/cm2 para 222 nm, mientras que para 254 nm las dosis a 17 y 42% de transformación fueron 36 y 18 mJ/cm2. La susceptibilidad al fotodaño del ADN plasmídico es dos veces menor a 222 nm. que a 254 nm debido a la absorbancia más débil del ADN a 222 nm14.

Eficiencias de transformación de E. coli HB101 en función de la dosis de UV al ADN plasmídico. (Círculo azul) 222 nm y (diamante verde) 254 nm. norte = 1.

Para evaluar la capacidad de fotorreparación del ADN dañado, dos conjuntos de muestras de ADN plasmídico que se redujeron al 20 % residual mediante irradiación UV se transformaron en E. coli en placas de ampicilina LB. Después de 60 minutos con y sin irradiación de fotorreparación a 365 nm (0,36 mW/cm2), se colocaron las placas para cultivo y luego se realizó el recuento de colonias. El número promedio de colonias para la irradiación de 222 nm fue N222 (con 365 nm) = 61 y N222 (sin 365 nm) = 40. Para la irradiación de 254 nm, N254 (con 365 nm) = 61 y N254 (sin 365 nm) ) = 31. La relación de incremento de fotorreparación a 222 nm es R222 = N222 (con 365 nm)/N222 (sin 365 nm)—1 = 61/40–1 = 0,53, mientras que a 254 nm, R254 = 61/31–1 = 0,97. Estos resultados implican que (a) la producción de CPD en ADN plasmídico irradiado a 222 nm es menor que a 254 nm y/o (b) la fotorreparación de CPD por la fotoliasa es menos activa a 222 nm que a 254 nm.

La fotoliasa alberga una coenzima FAD para revertir la CPD a las pirimidinas adyacentes. Como se muestra en la Fig. 6, la irradiación UV de FAD (25 μg/mL) en agua. La solución a 222 nm hasta una dosis de 18 J/cm2 indujo daño tres veces más eficientemente que a 254 nm, lo que implica que las fotorreparaciones de CPD realizadas por la fotoliasa se volvieron menos activas por la irradiación a 222 nm que a 254 nm. Los perfiles de elucidación por HPLC se muestran en la figura complementaria S6.

Reducción de FAD en función de la dosis. Irradiación UV a (círculo azul) 222 nm y (diamante verde) 254 nm. norte = 1.

El ADN consta de un esqueleto de azúcar-fosfato al que las cuatro nucleobases, adenina (A), guanina (G), citosina (C) y timina (T), están unidas mediante enlaces glicosídicos, mientras que T se reemplaza por uracilo (U) en ARN. Los espectros de absorción de los nucleósidos tienen un pico en el rango de 250 a 270 nm, y la columna vertebral absorbe alrededor de 210 nm. El fotodaño de estos nucleósidos en aq. La solución (50 μM) se investigó midiendo los cambios espectrales de absorción. Como se muestra en la Fig. 7, con dosis de hasta 5,0 J/cm2, las bases de pirimidina, C y U, resultaron fotodañadas de manera comparable por la irradiación de 222 nm y 254 nm. La base de pirimidina, T, resultó fotodañada a 222 nm pero no a 254 nm. Por lo tanto, T es más plausible para el daño UV del ADN plasmídico a 222 nm en la Fig. 5. De manera similar, no se observaron cambios apreciables en el espectro de absorción de las nucleobases de purina, adenosina y guanosina, tras la irradiación UV, como se muestra en la Fig. complementaria. .S7. Dado que el mecanismo de fotodaño es muy diferente entre el monómero de nucleósido y el plásmido debido a la diferencia de entorno, se necesitan experimentos adicionales para confirmar estas suposiciones.

Cambios en los espectros de absorción de los nucleósidos de pirimidina después de la exposición a una dosis creciente de UV a 222 nm y 254 nm hasta 5,0 J/cm2 con un paso de 1,0 J/cm2 desde el espectro en negro a uno en naranja. Concentración de soluciones acuosas = 50 μM y longitud del camino óptico = 10 mm.

RNA UpU es un bloque de nucleótidos modelo para ARN. Se irradió con luz ultravioleta UpU (50 μg/ml) en solución acuosa para evaluar las sensibilidades de longitud de onda al daño de UpU y la formación de (6-4)PP y CPD. Mediante análisis por HPLC con seguimiento a 258 nm, se midió la reducción de UpU por irradiación a 222 y 254 nm hasta una dosis de 4,5 J/cm2, como se muestra en la Fig. 8a. La tasa de degradación a 222 nm fue 1,9 ± 0,1 veces menor que a 254 nm. La Figura 8b muestra que la producción de (6-4)PP de UpU es 1,5 veces mayor mediante irradiación a 222 nm que a 254 nm, lo que implica que la producción de (6-4)PP a 222 nm es 2,9 veces (1,9 × 1,5) más eficiente que a 254 nm. Higos suplementarios. S8 y S9 muestran los cambios espectrales de UpU por irradiación UV y perfiles de elucidación por HPLC de los productos, respectivamente. Los análisis de HPLC muestran que se observó una señal de CPD débil para la irradiación de 222 nm, mientras que una fuerte para la irradiación de 254 nm. Según estos resultados, se espera que el rendimiento de fotorreparación del ARN dañado por la irradiación a 222 nm sea bajo en un proceso germicida.

Fotoquímica UV del ARN UpU. (Círculo azul) 222 nm y (diamante verde) 254 nm (a) reducción de UpU en función de la dosis. n = 1, (b) producción de (6-4)PP de UpU en función de la dosis. n = 1, (c) recuperación de UpU fotohidratado debido a la reacción de autorreversión a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad después de la irradiación UV. SD = 2% de cada intensidad de señal. norte = 3.

La irradiación UV de dTpdT produjo solo (6-4) PP a 222 nm, mientras que tanto (6-4) PP como CPD a 254 nm, como se muestra en los perfiles de elucidación por HPLC de la figura complementaria S10.

Además de los procesos habituales de fotodaño por irradiación UV, en una reacción de hidrólisis nucleofílica se añade una molécula de agua a través del doble enlace preexistente y se equilibra con el UpU18 no hidratado. La reacción reversible de la UpU hidratada se examinó y estas muestras se conservaron posteriormente durante hasta 120 h a temperatura ambiente en condiciones de oscuridad. El proceso de autorreversión de UpU hidratado a no hidratado se controló con una absorción de UpU de 215 nm en un análisis de HPLC. Los perfiles de elucidación después de la irradiación de 254 nm se muestran en la figura complementaria S11. La Figura 8c muestra las curvas de autorrecuperación de UpU dañada por la irradiación UV. UpU resultó dañada hasta un 4% residual (96% de daño) por irradiación a 254 nm a una dosis de 4,5 J/cm2. Después de la conservación durante 120 h, UpU se recuperó hasta un 68% residual. Así, el importe de la recuperación fue del 64%. A 222 nm con una dosis de 7,2 J/cm2, UpU sufrió daños hasta un 11 % residual (89 % de daño), que se recuperó hasta un 24 % residual. Así, el importe de la recuperación fue del 13%.

Tenga en cuenta que la formación de hidratos de timina mediante irradiación de 254 nm tiene un rendimiento cuántico bajo debido al impedimento estérico por el sustituyente 5-CH3 en la timina. Como se muestra en los perfiles de elucidación por HPLC en la figura complementaria S10, la irradiación UV de dTpdT a 254 nm produjo CPD y (6-4) PP, mientras que solo (6-4) PP a 222 nm.

La Tabla 1 resume la comparación de los daños y productos causados por la irradiación de 222 nm y 254 nm en proteínas celulares, quimotripsina, angiotensina II, ADN plasmídico, coenzima fotorreparadora FAD y bloques de dímero de uracilo/timina.

Los virus y microorganismos están formados por proteínas, ácidos nucleicos y carbohidratos, y su fotoquímica se rige por las propiedades de fotoabsorción. La débil absorbancia de las proteínas a 254 - 280 nm está dominada por los aminoácidos, y la absorción diez veces mayor alrededor de 200 nm por el enlace peptídico2,21. La absorción UV de las proteínas supera la del ADN a 220 nm y su mínimo es a 250 nm. El daño genómico del adenovirus fue inducido por irradiación a 254 nm, mientras que el daño proteico a 222 nm15,16. La irradiación de 220 nm dañó sus proteínas hexón y pentona22. Dado que el análisis genético parcial de su proteína hexón reveló 22 aminoácidos aromáticos (17 Tyr, 2 Trp y 3 His) entre 242 aminoácidos23, la irradiación UV puede inducir fotodaño directo de los residuos de aminoácidos. En el presente estudio, la dependencia observada de la longitud de onda de la degradación UV de la quimotripsina y la angiotensina II a 222 nm implica un fotoproceso directo de los residuos de His. La susceptibilidad al fotodaño de His a 222 nm es mayor entre los aminoácidos aromáticos, lo que se debe a la diferencia en la fotoestabilidad entre los grupos imidazol y fenilo. El análisis de inmunotransferencia de las proteínas virales y de la nucleocápside del SARS-CoV-2 mostró que la irradiación de 254 nm no indujo daño a las proteínas virales13, lo que es consistente con la actual dependencia de la longitud de onda de la degradación de His. La irradiación de 237 nm sobre anticuerpos monoclonales oxidó His en productos de modificación de residuos de His individuales a Asp (y/o iso-Asp) y Asn24. Sin embargo, la reacción de oxidación del His libre fue lenta en el presente estudio de irradiación de 222 nm. Esta dependencia de la longitud de onda en la fotoquímica UV-C de His puede explicarse por el hecho de que hay dos estados excitados electrónicos moleculares ubicados estrechamente en estas longitudes de onda, es decir, la banda de 220 nm se asigna principalmente a la excitación π-π* y la n El estado -π* está parcialmente poblado en la longitud de onda más larga25.

El espectro de infectividad viral coincide con el espectro de absorción de ARN en la región de longitud de onda larga, mientras que lo hace con el espectro de proteínas en la región de longitud de onda corta26,27. La irradiación UV por debajo de 240 nm daña las proteínas virales15,22. La desinfección UV del bacteriófago MS2 de E. coli se ve menos mejorada por cualquier mecanismo no genómico por debajo de 240 nm, a diferencia de la desinfección con adenovirus. Lo más probable es que esta diferencia se deba a diferencias en sus proteínas virales. En la Fig. 1, los efectos germicidas para las células de E. coli a 222 nm son más fuertes que los de 254 nm, mientras que en la Fig. 5 el efecto de longitud de onda para el ADN plasmídico está en orden inverso. Estos resultados respaldan el proceso eficiente de daño a proteínas en virus y microorganismos mediante irradiación de 222 nm.

Después de la exposición a 220–300 nm con una lámpara de mercurio de presión media, casi no se informó fotorreparación de E. coli K-12 debido al trastorno de la fotoliasa28. La fotodegradación de proteínas y la inactivación de enzimas fueron mucho más efectivas con la irradiación de 222 nm en comparación con la de 254 nm29. Por lo tanto, el bajo rendimiento de fotorreparación del ADN plasmídico dañado a 222 nm en el presente trabajo se debe a la degradación UV de la fotoliasa/FAD, así como al bajo rendimiento de las lesiones de CPD.

Con respecto a la autorreversión del daño fotoinducido en UpU, se informó que los fotohidratos de uridina se formaron después de la irradiación UV del ARN R17 monocatenario a través de una reacción de hidrólisis nucleofílica fotoinducida, en la que el agua se divide en un átomo de H y un radical OH mediante la fotosensibilización del uracilo30. . Estos radicales nacientes luego se agregan a través del doble enlace preexistente para formar los hidratos. El aducto de hidrato naciente era estable a 37 °C en una solución acuosa neutra, que estaba en equilibrio con el ARN no hidratado. En nuestros experimentos para la hidratación de UpU, el rendimiento de autorreversión a UpU no hidratado durante la conservación fue aproximadamente cuatro veces menor para UpU irradiado a 222 nm que a 254 nm. Esto podría aumentar la eficacia germicida de la irradiación de 222 nm. Para evaluar la eficacia germicida a 254 nm para virus, se debe considerar este proceso de reversión. Por ejemplo, en las mediciones de supervivencia de las células MS2 del bacteriófago E. coli en la Fig. 1a, una cantidad sustancial de uracilos hidratados se auto-recuperó a no hidratados después del proceso de cultivo de 24 h en el experimento de irradiación de 254 nm, pero una cantidad mucho menor. en el experimento de irradiación de 222 nm.

Un cálculo teórico para la hidratación mapeó las rutas de reacción asociadas con la reactividad del U con H2O18. Las energías de excitación vertical asociadas con los dos estados excitados electrónicamente más bajos del complejo U + H2O son los estados excitados electrónicamente, S1 a 4,96 eV y S2 a 5,20 eV por encima del estado S0 del suelo. La ruta de reacción a través de una energía mínima es una intersección cónica para formar un aducto de hidrato de 6-HU. En una excitación cercana al umbral de S1, tales acoplamientos necesitarían superar una barrera de energía de 5 eV asociada con movimientos nucleares ortogonales a reacciones alternativas. Las energías de los fotones UV a 254 nm (4,9 eV) y 222 nm (5,6 eV) son cercanas, pero pueden inducir diferentes caminos de intersección a través de S1 y S2, respectivamente. Por tanto, la proporción de ramificación de la producción de hidratos depende de la longitud de onda UV.

Para evaluar el daño de la membrana celular en células de E. coli NBRC.106373 en caldo LB, se utilizó un kit comercial (LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EE. UU.) en función de la integridad de la membrana. Después de la incubación y el lavado centrífugo, las células de E. coli en PBS se irradiaron a 222 y 254 nm. La intensidad y dosis de UV fueron 0,1 mW/cm2 y 200 mJ/cm2, respectivamente. La muestra se desplegó en un medio agar y se incubó a 37 °C durante 48 h para medir la curva de supervivencia. La muestra también se tiñó con una mezcla de tinte SYTO9 y yoduro de propidio proporcionada en el kit. La fluorescencia de células K-12 de E. coli vivas o muertas se midió a una longitud de onda de excitación de 485 nm. Las bacterias con membranas celulares intactas emiten fluorescencia verde a partir de SYTO9 en las membranas celulares, mientras que las células muertas con membranas comprometidas emiten fluorescencia roja porque el yoduro de propidio emite fluorescencia roja cuando se une a los ácidos nucleicos y no atraviesa las membranas celulares intactas.

Para las pruebas de daño UV del ADN plasmídico pBR322 (Takara Bio, Kusatsu, Japón) mediante irradiación a 222 y 254 nm, se adquirieron células competentes de E. coli HB101 Quick DH5α (ADN-913) de TOYOBO (Osaka, Japón). Tras la exposición a los rayos UV del ADN a 0,1 μg/ml en soluciones tampón TE (pH 7,5, Tris-HCl 1 mM/EDTA 0,1 mM), se transformaron células E. coli HB101 con el ADN plasmídico y se cultivaron en placas de agar LB que contenían ampicilina (50 μg/mL, Nacalai Tesque, Kyoto, Japón).

Se preparó ARN UpU, en el que se eligió un grupo levulinilo para la protección transitoria del grupo 3'-hidroxilo. Los productos de síntesis se analizaron mediante HPLC de fase inversa y espectrometría de absorción UV como se describe en Información complementaria. En el experimento de la proteasa, preparamos (1) solución A: α-quimotripsina (75 μg/mL, Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) en solución acuosa (HCl 1 mM), (2) solución B: BTNPA (1,6 mg/ mL, Peptide Lab. Ibaraki, Japón) en solución acuosa de DMSO al 50% y C) solución tampón C: Tris∙HCl 100 mM pH8. Después de irradiar la solución A con UV a 30 °C, para evaluar la inhibición por UV de la actividad catalítica, se sometió a una mezcla de solución A (60 cc), solución B (30 cc), solución C (150 cc) y agua (60 cc). monitoreado a una longitud de onda de 405 nm, sondeando el producto de hidratación, p-nitroanilina. En las mediciones espectrales de absorción se tuvo en cuenta el efecto de dilución provocado por el reactivo que detiene la reacción. Se adquirió un oligopéptido, angiotensina II (humana)∙AcOH∙ 4H2O de Peptide Lab. (Código 4001, Ibaraki, Japón). El instrumento de HPLC para el análisis de muestras y fotoproductos sintetizados fue Shimadzu Prominence con una columna de TSKgel ODS-80Ts (Tosoh, Tokio, Japón) y soluciones de acetato de trietilamina (TEAA) y TEAA/acetonitrilo. Se utilizaron FAD y albúmina sérica bovina (Nacalai Tesque, Kyoto, Japón) sin purificación adicional. La FAD se analizó con una solución 4:1 (fosfato hidrogeno potásico: metanol). dTpdT se adquirió de TriLink Biotechnologies (San Diego, EE. UU.). Aminoácidos (Trp, Tyr, Phe, His) en ac. Las soluciones (Nacalai Tesque) se midieron mediante HPLC con agua. solución de acetonitrilo/ácido trifluoroacético (TFA) para Trp, Tyr y Phe, y ácido 1-pentanosulfónico de sodio/acetnitrilo/ácido fosfórico para His. Los fotoproductos de la angiotensina II irradiada con UV se midieron con soluciones de TFA y agua. TFA/acetonitrilo. Los nucleósidos (A, G, C, T, U) se compraron en Tokyo Kasei (Tokio, Japón). Los tratamientos de desinfección por irradiación germicida ultravioleta utilizaron luz ultravioleta emitida desde una fuente de luz KrCl de 222 nm de espectro estrecho filtrada (222 nm, 100 μW/cm2 a 293 mm de distancia, Ushio Inc., Tokio, Japón, con luz de 235 a 280 nm eliminada) o una Lámpara de mercurio de baja presión de 254 nm de amplio espectro (254 nm, 100 μW/cm2 a 330 mm de distancia). El espectro VUV se informó en la Ref. 5 y en él se describió un medidor de UV.

En Información complementaria se proporciona una descripción de la corrección de la dosis de UV en muestras para fotoabsorción mediante soluciones de medios y placas de cultivo. Nos referimos a la dosis efectiva en este análisis. La desaireación del agua se realizó burbujeando gas nitrógeno con ultrasonificación. Las concentraciones de oxígeno fueron de 8 y 0,1 mg/L antes y después del procedimiento de desaireación, respectivamente. Los números de replicación, N (biológicos), son tres para todas las mediciones a menos que se indique lo contrario, y n (técnicos) fueron variables, que se describen en las leyendas de las figuras. Un experimento no se replicó cuando la diferencia entre los resultados con irradiación de 222 y 254 nm era clara.

Los conjuntos de datos que respaldan las conclusiones de este artículo se incluyen en el artículo y en la Información complementaria. Si los lectores desean obtener más información sobre los datos, comuníquese con KN.

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Este trabajo fue apoyado financieramente por Ushio Inc.

Masahiro Kawasaki

Dirección actual: Centro de Investigación del Ártico, Universidad de Hokkaido, Sapporo, 001-0021, Japón

División comercial de fuentes de luz, Ushio Inc., Bessho, Himeji, 671-0224, Japón

Keisuke Naito

Carbuncle Bioscientech Inc., Yoshida-Kawaramachi, Kyoto, 606-8305, Japón

Kazuyuki Sawadaishi

Departamento de Ingeniería Molecular, Universidad de Kyoto, Kyoto, 615-8530, Japón

Masahiro Kawasaki

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KN y KS realizaron los experimentos y analizaron los datos; KN y MK supervisaron los estudios y aportaron asesoramiento conceptual. Todos los autores contribuyeron a la preparación del manuscrito.

Correspondencia a Keisuke Naito o Masahiro Kawasaki.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Naito, K., Sawadaishi, K. y Kawasaki, M. Mecanismos fotobioquímicos de biomoléculas relevantes para la irradiación ultravioleta germicida a 222 y 254 nm. Informe científico 12, 18217 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-22969-5

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Recibido: 07 de julio de 2022

Aceptado: 21 de octubre de 2022

Publicado: 29 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-22969-5

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